細(xì)胞凍存步驟怎么做才更好？

細(xì)胞凍存步驟怎么做才更好？

細(xì)胞凍存簡(jiǎn)介

細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于 -196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，這樣在需要的時(shí)候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。

為什么要進(jìn)行細(xì)胞凍存

連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系容易發(fā)生遺傳漂變，有限細(xì)胞系終會(huì)發(fā)生衰老，所有培養(yǎng)的細(xì)胞都易受到微生物污染，即使運(yùn)轉(zhuǎn)情況的好的實(shí)驗(yàn)室也會(huì)遇到設(shè)備故障的問題。由于已建立的細(xì)胞系是一種寶貴資源，更換細(xì)胞系成本高昂，而且耗費(fèi)時(shí)間，因此，十分有必要將細(xì)胞冷凍起來長(zhǎng)期保存。除此之外，還可以利用細(xì)胞凍存的形式來購買、寄贈(zèng)、交換和運(yùn)送某些細(xì)胞。

培養(yǎng)細(xì)胞凍存方案

以下實(shí)驗(yàn)方案介紹了培養(yǎng)細(xì)胞凍存的一般流程。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案，必須參閱針對(duì)具體細(xì)胞的產(chǎn)品說明書。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

用具紫外照射消毒（30min）：無菌培養(yǎng)瓶，15ml 離心管，移液管，移液槍，槍頭。采用通風(fēng)機(jī)通風(fēng) 3min。以 75% 酒精擦拭操作臺(tái)和雙手，準(zhǔn)備好冰盒，離心機(jī)調(diào)節(jié)至 800rpm，5min。
配制細(xì)胞凍存液：凍存液應(yīng)該提前配置，于 2℃至 8℃下儲(chǔ)存，直至使用。凍存液常規(guī)通常配比為基礎(chǔ)培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1。加大凍存液中血清量有利于某些脆弱的肝細(xì)胞或珍貴的細(xì)胞的保存，可調(diào)整為血清：DMSO=9:1。

胰蛋白酶 /EDTA 消化

從培養(yǎng)箱中取出待傳代的細(xì)胞（將蓋子擰緊），75% 酒精進(jìn)行瓶口消毒，吸掉培養(yǎng)細(xì)胞的舊培養(yǎng)基，PBS 緩沖液洗去殘留的舊培養(yǎng)基，加入消化液，放入顯微鏡下觀察，待所有細(xì)胞變圓后立即拿入超凈臺(tái)內(nèi)，加入細(xì)胞*培養(yǎng)基中止消化，消化時(shí)間為 1-5min，具體以細(xì)胞而異，采用無菌吸管輕輕吹打細(xì)胞表面，注意吹打全部培養(yǎng)表面，取所有的細(xì)胞懸液放入干凈的 15ml 離心管內(nèi)，每分鐘 1000rpm，5min。

細(xì)胞凍存

取出凍存管，注明細(xì)胞名稱，代數(shù)，日期。離心后，以無菌吸管吸棄上清，不要吸到底部的細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀與凍存液充分混勻，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞總數(shù)調(diào)節(jié)成細(xì)胞數(shù)量為 5-10*105/ml 為宜。將細(xì)胞凍存懸液分裝進(jìn)細(xì)胞凍存管中，一般 2ml 的凍存管中裝入 1-1.5ml 凍存液為宜。嚴(yán)密封口后，使用可控制降溫速度的冷凍裝置冷凍細(xì)胞，使溫度每分鐘大約降低 1℃。或者，將裝有細(xì)胞的凍存管放入異丙的醇凍存盒中，然后將凍存盒置于 –80℃條件下過夜。若無凍存盒及其他凍存裝置，可以先將凍存管置于 4℃ 30min，再 -20℃凍存 1h 直至*冷凍，再轉(zhuǎn)移至 -80℃冰箱過夜。第二天將已經(jīng)冷凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮容器中，置于液氮上方的氣相空間中儲(chǔ)存。

注意事項(xiàng)

凍存細(xì)胞系以備將來之用時(shí)，必須遵守以下原則。我們建議您嚴(yán)格遵守您所用細(xì)胞系附帶的操作說明，以便獲得的佳結(jié)果。
• 在細(xì)胞處于生長(zhǎng)期密度達(dá)到 70-90% 的情況下進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞的凍存，并且細(xì)胞傳代盡可能靠前。確保凍存前活細(xì)胞百分比至少為 90%。請(qǐng)注意的佳凍存條件取決于所用細(xì)胞系。
• 細(xì)胞應(yīng)緩慢冷凍，可使用可控制降溫速度的低溫冰箱或者低溫冷凍容器，使溫度每分鐘大約降低 1°C。
• 必須使用推薦的凍存培養(yǎng)基。凍存培養(yǎng)基中應(yīng)含有 DMSO 或者甘油等冷凍保護(hù)劑。冷凍保護(hù)劑可降低培養(yǎng)基的冰點(diǎn)，并可減緩冷卻速度，大大降低冰晶形成的危險(xiǎn) (冰晶可損傷細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡)。注：DMSO 可促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織。操作含 DMSO 的試劑時(shí)，應(yīng)采用與此類物質(zhì)安全危害相適應(yīng)的設(shè)備和操作規(guī)范，并應(yīng)按照當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)處置此類試劑。建議可使用廠商生產(chǎn)的無血清細(xì)胞凍存液，使用方便，復(fù)蘇率高。
• 注意冷凍保護(hù)劑 DMSO 的品質(zhì)：DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無菌且無色，以 5-10ml 小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。
• 將冷凍的細(xì)胞于–70℃以下溫度儲(chǔ)存；溫度高于–50℃時(shí)，冷凍的細(xì)胞將開始變質(zhì)。
• 必須使用無菌凍存管儲(chǔ)存冷凍的細(xì)胞。裝有冷凍細(xì)胞的凍存管可浸于液氮或者在液氮上方的氣相空間內(nèi)保存。生物危害性物質(zhì)必須儲(chǔ)存在液氮上方的氣相空間內(nèi)。將密封的凍存管置于氣相空間儲(chǔ)存可避免凍存管發(fā)生爆炸。如果使用液氮進(jìn)行儲(chǔ)存，必須注意玻璃和塑料凍存管有發(fā)生爆炸的危險(xiǎn)，應(yīng)佩戴面罩或護(hù)目鏡。
• 所有與細(xì)胞接觸的溶液和設(shè)備均應(yīng)為無菌狀態(tài)。必須采用正確的無菌技術(shù)，并且在層流通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。
• 實(shí)行細(xì)胞慢凍的原則：緩慢凍存，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。而復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。

HAKATA無血清細(xì)胞凍存液，直凍-80°C，無需程序降溫