外泌體研究常見問題匯總

外泌體（Exosome）發現于1986 年，是一種直徑約30~100nm 的雙層膜囊泡狀結構小體，可由機體內多種細胞如免疫細胞、干細胞、心血管細胞、 網織紅細胞、 血小板、 神經細胞和腫瘤細胞等主動分泌產生， 廣泛分布于外周血、尿液、唾液、 乳汁、腹水、羊水等體液中。

外泌體攜帶大量特異性的蛋白質（如細胞因子、生長因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物質，在體內參與細胞通訊、細胞遷移、促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過程，與多種疾病的發生和進程密切相關。由于外泌體的特殊結構和功能， 使得它具有潛在的應用價值，一方面可以作為診斷多種疾病的生物指標，另一方面也可以作為治療手段，未來有可能作為藥物的天然載體用于臨床治療。

01

外泌體研究，應選用血漿還是血清？

答：

血清是血液凝固之后收集的液體，所以其中少了纖維蛋白原，凝血因子，以及多了很多凝血產物。纖維蛋白原可轉化為纖維蛋白，具有凝血功能。在凝血過程中血小板會分泌大量的外泌體，有研究發現血清中有接近50%的外泌體來自額外的分泌。

血漿=血液-血細胞

血清=血漿-纖維蛋白原-凝血因子

所以一般實驗選擇血漿，在特殊情況下，如研究與血小板相關的疾病的時候，當然是血清更適合。

02

外泌體的分離方法這么多，選擇哪種更好？

答：

外泌體的分離純化一直是科研工作者關注的問題，獲得高純度的外泌體對后續的研究至關重要。據了解，目前人們多采用超速離心、免疫磁珠、 超濾、 沉淀或試劑盒等方法實現外泌體的提取分離：
1、 超速離心法（差速離心）

超離法是常用的外泌體純化手段，采用低速離心、高速離心交替進行（ 如圖所示） ，可分離到大小相近的囊泡顆粒。超離法因操作簡單，獲得的囊泡數量較多而廣受歡迎，但過程比較費時，且回收率不穩定（可能與轉子類型有關），純度也受到質疑；此外，重復離心操作還有可能對囊泡造成損害，從而降低其質量。

2、密度梯度離心

在超速離心力作用下，使蔗糖溶液形成從低到高連續分布的密度階層，是一種區帶分離法。通過密度梯度離心，樣品中的外泌體將在 1.13-1.19g/ml
的密度范圍富集。此法獲得的外泌體純度較高，但步驟繁瑣，耗時。

3、超濾離心

由于外泌體是一個大小約幾十納米的囊狀小體，大于一般蛋白質，利用不同截留相對分子質量(MWCO)的超濾膜對樣品進行選擇性分離，便可獲得外泌體。超濾離心法簡單高效，且不影響外泌體的生物活性，是提取細胞外泌體的一種新方法。

4、磁珠免疫法

外泌體表面有其特異性標記物（如 CD63、 CD9 蛋白），用包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結合，即可將外泌體吸附并分離出來。磁珠法具有特異性高、操作簡便、不影響外泌體形態完整等優點，但是效率低，外泌體生物活性易受 pH 和鹽濃度影響，不利于下游實驗，難以廣泛普及。

5、PEG-base 沉淀法

聚乙二醇（ PEG）可與疏水性蛋白和脂質分子結合共沉淀，早先應用于從血清等樣本中收集病毒，現在也被用來沉淀外泌體，其原理可能與競爭性結合游離水分子有關。利用PEG沉淀外泌體存在不少問題：比如純度和回收率低，雜蛋白較多（ 假陽性），顆粒大小不均一，產生難以去除的聚合物，機械力或者吐溫-20 等化學添加物將會破壞外泌體等，因此發表文章時易受質疑。

6、 試劑盒提取

近幾年來，市場上已出現各種商業化的外泌體提取試劑盒，有的是通過特殊設計的過濾器過濾掉雜質成分，有的則采用空間排阻色譜法(SEC)進行分離純化，也有的則利用化合物沉淀將法外泌體沉淀出來。

03

外泌體提取試劑提取外泌體檢測需要多少血漿呢？

答：

1-2mL的血漿足夠后續的QPCR檢測；4mL的血清或血漿可滿足RNA測序和蛋白質譜的需求。

04

如何鑒定提取出來的外泌體？

答：

根據國際細胞外囊泡協會于2014年發表的一個指導手冊（MISEV），鑒定外泌體首先需要通過WB來鑒定細胞外囊泡的標志蛋白是否存在于樣品中，通過電子顯微鏡來觀察樣品中細胞外囊泡的形態特征，通過NTA等手段來分析樣品中細胞外囊泡的群體特征（粒子濃度、直徑分布等）。

05

提取出來的外泌體能否應用于細胞共培養？

答：

我們提取出來的外泌體通過粒徑檢測能判斷其純度（粒徑大小均在外泌體的大小范圍），電鏡檢測能判斷其形態確為外泌體。

如果樣品中的外泌體有活性的話是可以進行細胞共培養的實驗的。

06

外泌體如何保存？

答：

純化完成后的外泌體可分裝成50-100uL后置于-80℃保存。

07

外泌體提取試劑盒從2mL血清血漿提取出來的外泌體能有多少？

答：

2mL血清血漿提取出來的外泌體數量約1*10的8次方-9次方，可以滿足后續的電鏡和WB。

08

BCA方法測定的蛋白濃度是多少？

答：

BCA方法測定的蛋白濃度為2~4ug/uL。

09

外泌體電鏡是不是一定要有膜結構，無膜結構的球體對不對？

答：

負染電鏡結果中外泌體的形態肯定是那種明顯的茶托樣或者大餅樣的！邊緣有一圈略微更明亮的亮圈。如果你打到的結構是沒有膜結構的圓球形，那么您很可能看到了脂蛋白顆粒或者抱團的蛋白質。

10

為什么超速離心提取外泌體看不到沉淀？

答：

這種問題通常有三種可能性：

1）使用的細胞上清或者血清量太低，從而造成了這樣的結果。

2）使用了不透明的超速離心管，一般來說外泌體產量都比較小，所以凡是不透明的管子，基本都是很難見到明顯沉淀的，可以當做有沉淀，然后操作下去即可。

3）使用了角轉。部分品牌離心機的角轉管壁粘附性很低，超離結束沒多久沉淀就會滑落下去，所以請在離心結束時趕緊去收樣。