細胞培養出現小黑點是什么原因 如何解決？

在細胞培養中常可見到細胞及培養液中有一些大小不等、形態不同的黑色未知顆粒，去網上查詢得到的答案也多種多樣。

那么這些小黑點究竟是什么？我們又該怎么去應對這種情況？

細胞碎片類

在細胞培養的時候， 由于細胞代謝、物質交換、周邊環境變化，尤其是在從37度培養箱中拿出來觀察的過程中，由于液體培養基的比熱較大，液內溫度高于外界溫度，造成冷熱交換、小范圍內形成液體流動加劇，當然這些小碎末就會被攪動起來形成似乎“游動"的感覺；隨著細胞培養的繼續，部分細胞開始衰亡，細胞膜結構破裂，破裂之后的細胞內容物泄露到培養液中。尤其是溶酶體的破壞，連續性地造成其他細胞和細胞器的損傷，如果換液不很勤，又會出現進一步破壞和殘渣的出現；

再者，“小黑點"問題是很多細胞培養者已經發現的問題，但到目前為止尚未找到其監測和排除的試劑和手段，這首先是由于所謂“小黑點"病原體根本難以收集和捕捉， 這也從另一個側面證明了“小黑點"問題的難以確定性；再說任何一種外來的微生物在培養基中都會有生命活動的反應和表現，而不是簡單地運動那樣的外觀性表現。

舉一個例子：如果“小黑點"的運動狀況已經到了用顯微鏡已經可以觀察出的程度，其營養代謝和能量需求也就可想而知。這樣，培養液中的影響消耗、酸堿含量程度等都要發生明顯變化。

比如說：迅速的、大含量的沉淀， pH值的迅速下降，細胞大量破碎死亡、引發其它類型微生物侵染等等。而這些狀況，在所謂的“小黑點"感染中，是很難觀察到的。同時“小黑點"的出現而影響細胞狀態似乎得不到有力的證據。倒是細胞狀態下降的時候，“小黑點"明顯增多了。很有可能是細胞狀態下降時，細胞衰亡產生的細胞碎片。所以小黑點屬于細胞碎片是比較可能和合理的。

玻璃培養瓶中的類似氧化硅的東西

網上有一篇文章說，小黑點其實不是一種生物，是無機物，其本質是玻璃培養瓶里的硅顆粒。可影響細胞生長，細胞狀態好時，不明顯。細胞狀態較差，數量少時才容易看到，好的辦法是用一次性培養瓶，可消除小黑點影響。

支原體

有人曾認為小黑點可能是支原體污染，小黑點可以通過濾膜，可以在空氣中傳播。而恰巧口腔支原體為人體口腔中之正常菌叢，所以實驗室之操作人員的污染亦可能為支原體的污染源。但有人為此做了實驗證明小黑點不會是支原體，原因如下：

1、光鏡下可見, 因為體積不對，支原體在普通顯微鏡下不能看到。

2、多種染色后可見，甚至hoechst即能將它染色,一般來說支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。所以，小黑點是一種支原體的可能性比較小。

真菌

有很多人發現類似小黑點的，但最后確定是真菌，二性霉素B對其有效。那說明小黑點不存在只是細胞培養中的真菌感染，還是說明小黑點屬于真菌類污染物。如果小黑點是一種真菌，那么由此引起的污染是不會引起那么多人的關注，即使它很特殊。但是這不能排除那些認為“小黑點"是真菌的細胞者，看到的只是一般真菌感染。由于細胞被感染了，要進行拯救處理，不像理論上那么簡單，稍有不注意都是很容易導致培養失敗，所以小黑點是一種真菌也是不太可能。

寄生類原蟲

小黑點屬于寄生類的原蟲，而不是細菌、支原體，也不是什么補體、細胞碎片或蛋白沉淀。有人在400倍以上的高倍鏡下可以清楚的看到它有兩種不同形態，一種較大，運動較慢，泛紅光；另一種較小，運動較快，紅中帶綠，個小的圍著個大的分布，很可能是公的圍著雌的。這種生物也并非離開細胞就不能存活，也有人做過這樣的試驗，單純培養過污染小黑點的血清4周，直到滿視野都是黑煤渣般的小黑點。給人的感覺是小黑點和細胞一樣有叢集性，如果密度低則生長緩慢，如果手懶，拖了幾天沒換液，待生長到一定濃度后便會飛速分生，細胞受感染的程度也大，這時除了培養基中可見外，細胞表面通常也象長滿了粉刺，所以有人認為細胞旁分泌的某些因子可以抑制小黑點的生長。

據說，中國病毒所和軍科院鑒定是一種寄生于牛血清內的一種原蟲，似乎和草履蟲和變形蟲有類似之處，然而由于課題經費不夠而不能繼續進行下去，所以并沒有明確的證據證明此項猜測的正確性。

那么如果您在細胞培養的過程中發現有黑點生成，可采取下列步驟：

首先，要肉眼觀察培養基是否混濁，

然后，在鏡下觀察培養細胞生長的狀態，黑點是否游動。

如果細胞被污染，微生物則會大量繁殖，培養基就會迅速變黃、變混濁。污染包括細菌污染、支原體污染等。

如果在鏡下觀察細胞，生長狀態良好，與黑點出現前相比，沒有任何變化，那么，黑點的出現可能與以下幾種情況有關：

(1)細胞生長過老，破碎的細胞殘骸;

(2)血清質量不好，反復凍融的結果;

(3)配制培養基的pH值偏高，不宜細胞生長;

(4)配制培養基的水質、容器不合格。可應用離心、過濾的方法去除這些黑點;

(5)培養原代細胞中出現小黑點，可能是原代組織中的雜質，多次傳代可以消除。

以上就是小黑點會出現的可能原因，建議您購買HAKATA血清進行實驗，達到理想的細胞培養效果。