流式細胞術實用技巧！

流式細胞技術（flow cytometry，FCM）是利用流式細胞儀進行的一種單細胞定量分析和分選技術。流式細胞術是單克隆抗體及免疫細胞化學技術、激光和電子計算機科學等高度發展及綜合利用的高技術產物。

一、基本結構
流式細胞儀由三部分構成
1.液流系統，包括流動室和液流驅動系統;
2.光學系統，包括激發光源和光束收集系統;
3.電子系統，包括光電轉換器和數據處理系統。流式細胞儀的I作原理是使懸浮在液體中分散的經熒光標記的細胞或微粒逐個通過樣品池，同時由熒光探測器捕獲熒光信號并轉換成分別代表前向散射角、側向散射角和不同熒光強度的電脈沖信號，經計算機處理形成相應的點圖，直方圖和加三維結構圖像進行分析。用于FCM的樣本是單細胞懸液，可以是血液、懸浮細胞培養液、各種體液、新鮮實體瘤的單細胞懸液以及石蠟包埋組織的單細胞懸液等。

二、流式細胞術的基本操作與技巧
1）細胞的制備、培養
2）封閉
3）熒光素偶聯抗體標記
4）光電倍增管電壓的設定
5）對照的設置
6）補償調節

以體外培養的PBMC細胞為例：
1、細胞培養在96孔板中，直接收集細胞于1.5ml的EP管中，350g，4°C離心5min，棄上清；
2、然后用1ml FACS buffer重懸沉淀，350g，4°C離心5min，棄上清；
3、封閉：標記樣品細胞的熒光素偶聯抗體多為單克隆抗體，少數也可能是多克隆抗體，其基本結構都由兩部分組成，即包含有特異性結合抗原位點的Fab段和相對保守的Fc段，抗體的特異性表現在Fab段，標記時利用Fab段的抗原結合位點與細胞上抗原分子特異性結合，從而標記并且相對量化細胞表達該抗原分子的情況。但是，有些細胞表面表達FcR(Fc receptor, Fc受體），如巨噬細胞、DC、B淋巴細胞等， FcR可以與熒光素偶聯抗體的Fc段進行非特異性的結合，對結果產生一定的影響。

封閉方法1： 取適量的血清全IgG抗體與樣品細胞充分混勻，4'C靜置 15min。研究人的細胞時，若熒光素偶聯抗體來源于小鼠，封閉采用小鼠血清全IgG抗體。原則是，如果流式抗體可能與樣品細胞的FcR發生非特異性結合，那么在標記熒光素偶聯抗體之前先用流式抗體同源的全IgG抗體進行封閉，使樣品細胞表面的FcR飽和。

封閉方法2： 適量的抗CD16和抗CD32單克隆抗體與樣品細胞充分混勻，4'C靜置 15min。CD16是一種FcR, 能夠與IgG的Fc段結合，親和力較強；CD32也是一種 FcR, 能夠與IgG的Fc段結合，親和力中等。而熒光素偶聯抗體基本上是IgG抗體，所以在標記熒光素偶聯抗體前可以用抗CD16和抗CD32單克隆抗體封閉樣品細胞，使樣品細胞表面的FcR都被抗CD16 或抗CD32單克隆抗體結合，從而阻止后續熒光素偶聯抗體與FcR的非特異性結合。

4、標記相應的熒光素偶聯抗體，這里以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC為例，一般染色體系推薦100μl，CD3、CD4表達量相對較高，1μl足夠了，假如有9個樣本，分別取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混勻后，分別取100μl加到9個樣品孔中，混勻，室溫、避光染色20min；

5、加1ml FACS buffer洗去未結合的抗體，350g，4°C離心5min，棄上清，用200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重懸沉淀，盡快上機分析。

6、電壓的設定：上機分析時，確認機器沒有問題后，首先就是調節每個通道的光電倍增管的電壓，目的是為了區分細胞群，假如我們想研究人的淋巴細胞群，我們都知道人的PBMC含有淋巴細胞、單核細胞還有中性粒細胞等，那我們怎么把它們分開呢？這時候就要用到我們前面提過的FSC和SSC，通過調節FSC和SSC的電壓，區分淋巴細胞亞群，原則就是使樣品細胞或者目標細胞位于流式圖的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的電壓確定之后就開始調節APC-cy7、FITC的電壓（我們可以在鋪細胞的時候多鋪一個孔，染色時將CD3-APC-cy7、CD4-FITC均染上，用于FSC、SSC、APC-cy7、FITC電壓的調節），原則就是使陽性細胞群和陰性細胞群盡可能的分離。

三、注意事項

（1）在細胞制備、培養階段，如果該培養細胞是貼壁細胞，需用先用胰酶消化細胞，然后收集待測樣品細胞，離心、洗滌、封閉后標記熒光素偶聯抗體即可。

（2）如果是胸腺、脾臟和淋巴結等外周免疫器官，主要由免疫細胞組成，制成單細胞懸液，只需直接將臟器經鋼網研磨即可。

（3）如果是實體臟器肺臟、肝臟和腫瘤組織內含有較多的結締組織，實體臟器細胞之間一般結合緊密，所以直接研磨臟器法無法得到理想的單細胞懸液。因此，研磨前需將臟器剪碎后加入IV型膠原酶和DNA核酸內切酶消化，消化后的組織再用研磨棒直接研磨。實體臟器研磨后的單細胞懸液以實體細胞為主，如果研究目標不是實體細胞，而是臟器內浸潤的免疫細胞，可以用Percoll密度梯度離心法富集免疫細胞，然后再進行流式分析。

（4）調節電壓時，如果檢測的目標細胞體積較小，可以適當提高電壓值，使目標細胞與細胞碎片在流式圖中能夠*分離；如果檢測的目標細胞體積較大，可以適當降低電壓值，使所有的目標細胞群完整顯示于流式圖中，防止細胞群接近于流式圖的邊界而變形扭曲或者*處于邊界外。

（5）關于樣本的封閉，并不是標記熒光素偶聯抗體之前必須封閉樣品，一般樣品細胞與流式抗體的種屬來源是不同的，如標記人的細胞的熒光素偶聯抗體一般來源于小鼠，人細胞的FcR也不一定能夠與小鼠來源的熒光素偶聯抗體的Fc段結合，但是，也有可能因為種屬關系較近，或者在一定環境條件下這種不同種屬間的Fc段和FcR也能結合，實驗者很難判斷實驗過程中這種結合是否會發生，但是在標記熒光素偶聯抗體前封閉樣品卻可以保證這種非特異性結合一定不會發生。所以，條件允許的話，實驗者最好養成封閉樣品的習慣。